PCR引物設計的基本思路

根據PCR實驗需要，確定需要擴增的DNA序列，并知道其CDS區序列（編碼結構基因區,即從起始密碼子區至終止密碼子區） ncbi網站查詢
 

 RBS             149..153

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 

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2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點。

所選擇的酶切位點盡量為多克隆位點的中間酶切位點，且載體上其它地方無該酶切位點。這樣連接以后再構建新的質粒時選擇酶的空間更大些。并保證所需擴增的DNA序列中無該酶切位點（generuner分析）。

3.初步確定設計的引物長度。

 一般為15～30bp，引物過短會影響到擴增的特異性，過長會影響擴增速率。如果擴增產物≤500bp，引物長度為16～18bp即可。若擴增產物為4～5kb，引物最好不要少于24bp。引物3’末端應含有所研究基因特異序列中的17～30bp。

4. 正向引物的設計：

4.1 酶切位點的位置選擇。一般情況下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位點，然后利用該酶將擴增產物切下，接到相應的載體上。

A：擴增的DNA用于表達時：

自身有啟動子。如：

LOCUS       VITVHBA                  689 bp    DNA     linear   BCT 26-APR-1993

DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.

ACCESSION   M30794 M31721 X13516

VERSION     M30794.1 GI:155319

KEYWORDS    hemoglobin; promoter region.

SOURCE      Vitreoscilla sp.

 ORGANISM Vitreoscilla sp.

REFERENCE   1 (bases 42 to 689)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotide

 JOURNAL   Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)

 MEDLINE   89143453

REFERENCE   2 (bases 1 to 210)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     Characterization of the oxygen-dependent promoter of the

 JOURNAL   J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)

COMMENT     Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.

FEATURES             Location/Qualifiers

    -10_signal      73..79

ORIGIN     

擴增片段里應包含啟動子，所以酶切位點應該在啟動子前面。

可在所擴增的DNA序列的啟動子前尋找是否有該酶切位點，若有則直接利用該酶切位點進行擴增；若無可尋找與其基本相似的位點進行擴增。

（2）擴增片段里自身無啟動子。

因為在5’端增加的酶切位點（所選的酶切位點與啟動子的酶切位點相同）中必須含起始密碼子，如NcoI（CCATGG），Nde I(CATATG),設計引物時，酶切位點的起始密碼子要和DNA序列的起始密碼子重疊.如上例：若添加的酶切位點為NdeI，引物的5’端酶切位點應設計位5’—CATATGTTAGAC—3’;若添加的酶切位點為NcoI,因為其位點ATG后的G與DNA起始密碼子后的T不配對，在處理這個問題上有兩種方法：一種是用G取代T,其缺點是破壞了閱讀框，可能對表達會有影響；另外一種方法是將酶切位點上的G改為T,相應的酶切位點應改為ACATGT,并查詢是否有該酶存在,若有，可以直接利用，因為同尾酶也可連接。若無，可用平末端連接。

B：若擴增的DNA用于阻斷.如eryF:

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 因為只需要擴增出一定長度的與染色體DNA同源的序列就可以，所以對酶切位點的位置無特殊要求。只需要尋找與所需擴增的DNA配對較好的區域作為酶切位點就行。如上，可選擇ggatcc.

4．2克隆PCR產物的方法之一，是在PCR產物兩端設計一定的限制酶切位點，經酶切克隆到用相同酶切的載體上。但實驗證明，大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護堿基，才能使所定的限制性酶對其識別位點進行有效切斷。加的個數見Biolabs242所示，加的種類要和擴增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs顯示在其酶切位點上加4個核苷酸時，酶切2小時，酶切效率達到50%，而加1個核苷酸時，酶切20小時酶切效率仍然為0%，所以應在酶切位點前加4個核苷酸；為了達到盡可能與需要的DNA配對，所以應選gaac;

4.3 在所添加的酶切位點后加17-30個與擴增的DNA配對的核苷酸序列。

結合以上幾點，對于vhb基因5’端引物可以為5’---gaac CATATG ttagac cagcaaacca ttaacatc—3'。

對于eryF基因可設計為5’--nnnggatcccgat cgtgtcggag gaag—3’

4不同細胞對密碼子的使用頻率各不相同，密碼子的使用頻率與細胞內相應tRNA的豐富是一致的，密碼子使用頻率高意味著需要較多的相應tRNA，二者之間的相互協調有利于細胞內一些含量高的蛋白質的順暢表達。同理，當人們期望人工合成的基因能在細胞內高效表達，也要選擇該細胞偏好的密碼子作為基因的密碼子，這樣可以充分利用細胞內豐富度高的tRNA，使基因得到高效表達。所以對引物起始密碼子以后的幾個密碼子要根據密碼子的簡并性進行改變。大腸桿菌基因密碼子的使用情況：原核生物的代表大腸桿菌基因的研究開展最早，進展也最快。比較了大腸桿菌中13種含量較多的蛋白質的密碼子使用情況發現這些高度表達的基因中密碼子的使用有以下規律：對于以C或U結尾的同義密碼子，如前兩個堿基為A、U，則第三個堿基優先使用C；前兩個堿基為C、G，則第三個堿基優先使用U。這樣的選擇有利于在翻譯時密碼子與反密碼子相互作用，兩者的作用能不太強也不太弱，而一中度為宜即所謂最適相互作用能。

 

 

5.反向引物的設計

表達時，要考慮終止密碼子的位置，所擴增的片段里必須包括終止密碼子 ，所以酶切位點應該在終止密碼子后尋找。酶切位點的選擇原理與5’端一樣。

擴增的DNA用于阻斷。與表達時相同，只是無需過于要求酶切位點的位置。

6.應注意堿基分布的均衡性。引物應避免嘌呤或嘧啶的堆積現象，避免連續出現4個以上的同一堿基。

7.檢查兩條引物是否存在二級結構或二聚體。（dnaman分析）如上，VHB ggatcccgat cgtgtcggag gaag；

Two primers complementarity.

Max complementarity in continuous: 4 bp, free energy=-1.60 Kcal/mol

3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

Max complementarity in discontinuous: 9 bp

5'-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3'

 3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

8.計算Tm值。

一般退火溫度為55℃～60℃，而Tm值比退火溫度高5～15℃。兩條引物的Tm值最好相同，相差不要超過3℃。

9.特異性分析。必須保證酶切位點后的特異性序列在已知的序列中不存在，否則會出現非特異性條帶。

EryF引物

正向:

 5’-AAGGATCCAAGTCGCGCCGCCC-3’

反向:

 5’-CAAGGATCCCATGCTGTGCCCGAA –3’

 

PCR反應量的選擇：

要擴增的是總DNA，在PCR反應前應預先變性總DNA（即100℃水浴中煮沸5～10min）

酶的選擇

對于擴增高GC的片段，應使用LA Taq 酶，緩沖液也應該用GC Buffer.

3. 酶量的選擇

酶量過多時易發生非特異性反應；而酶量過少時，反應性能下降。一般50ul的體系可使用2.5U的酶（即5U/ul,加0.5ul）

模板DNA的用量

總DNA為0.1～1 ug；片段DNA為0.1～10ng。

引物用量

終濃度為0.1～1.0uM。引物濃度太低時，有時擴增產物太少；引物濃度太高時，比較容易出現非特異性擴增反應。通常模板DNA的量較多或High complexity DNA(如總DNA)作模板時，引物濃度應該低一些；當模板DNA的量較少或Low complexity DNA（如plasmid等）作模板時，引物濃度應高一些。

 ddH2O              9.5ul

 2×Gcbuffer        25ul 用量參考TaKaRa目錄

 dNTP               8ul

 Primer 1 0.5ul (稀釋后的濃度為25uM,終濃度0.25umol/L)

 Primer 2 0.5ul(終濃度0.25umol/L)

 LA Taq 0.5ul(產品濃度為5U/ul)

 總DNA 6ul(濃度是0.05 ug/ul,質量為0.3ug)

 50ul體系

PCR反應

PCR的反應液應在冰中調制，然后安置于PCR反應儀上進行PCR反應。這種冷啟動法可增強PCR反應的特異性，減少PCR反應中的非特異性帶，能得到良好的PCR反應結果。

PCR反應條件的選擇

變性時間、溫度及延伸溫度基本固定

退火溫度一般為55～60℃，對于GC%小于50%，一般用55℃；GC%≥50%時一般用60℃。退火溫度太高會得不到擴增產物；太低時容易發生非特異性反應。若此時有非特異性帶，可提高退火溫度，但不應高于68℃，因為合適的退火溫度應在45～68℃之間。

退火時間：一般以每Kb設定在30s～1min 。

延伸時間：延伸時間太短時，會的不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優先生成；而太長時，會出現涂布現象。一般擴增片段≤500bp,采用1 min ;大于500bp時，采用3min。

95℃ 5min

94℃ 1.5min

65℃ 30s         ×30

72℃ 2min

72℃ 7min

 

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提示：本文PCR引物設計基本思路屬于引物設計文章，主要介紹引物設計、PCR引物設計方面的知識，內容僅供學習交流與參考，不代表創博環球（北京）生物科技有限公司的觀點。